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植物瞬時表達系統(tǒng)的侵染方法有葉片注射法、真空侵染法和摩擦接種法等。這些侵染方法的操作都較為繁瑣，不適合大量植物的侵染工作，而且都具有各自的局限性。本文介紹的新型侵染技術(shù)—種子吸收法，是通過種子自然吸收菌液的能力進行外源蛋白的表達。我們采用這種侵染方法在番茄(S. lycopersicum)中成功表達了GFP蛋白，其表達量約占植株總可溶性蛋白的4.85%。與之前的侵染方法相比，這種侵染技術(shù)不僅有利于植物大規(guī)模的侵染工作，提高生產(chǎn)效率，有利于植物瞬時表達系統(tǒng)的進一步推廣和應(yīng)用，而且能夠侵染葉片面積小、葉形狹長或者難以注射的植物，如番茄、大豆等，進一步擴大了植物生物反應(yīng)器的宿主范圍。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時表達體系的建立

制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞 EHA105，采用凍融法將 1 μL 質(zhì)粒 30B-GFP 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 EHA105中。將培養(yǎng)物在 12 000 r/min 下離心 1 min，將所收集到的菌體用 50 μL LB 培養(yǎng)基重懸，涂在含有 50 μL/mL，和 25 μg/mL 的 LB 培養(yǎng)基平板上。在 28℃條件下，培養(yǎng)2-3 d，可在培養(yǎng)基上選出陽性克隆。

利用種子吸收法侵染番茄與 GFP 表達的表型觀察

利用凍融法將質(zhì)粒 30B-GFP 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài) EHA105 中，對轉(zhuǎn)化平板上的單菌落進行菌落 PCR，將陽性菌落進行過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后作酶切鑒定。將成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài) EHA105 的陽性克隆保存菌種，用于菌液重懸液的制備。用菌液重懸液 OD600 =1.0 侵染番茄(S. lycopersicum)發(fā)芽種子 24 h 后，繼續(xù)用水培法培養(yǎng)一周；將小苗移栽花盆中，侵染后 7 d 在新生葉中觀察到綠色熒光，GFP 的表達表型在的LUYOR-3410長波高強度紫外線燈照射下觀察。侵染后 7~14 d，葉片中的熒光現(xiàn)象逐漸加強，在侵染后 14 d，多數(shù)莖和葉片中有較強的綠色熒光積累；而侵染 空載體的對照植物中未觀察到綠色熒光現(xiàn)象。

種子吸收法侵染條件的優(yōu)化

首先對影響 GFP 表達的關(guān)鍵因素—菌液濃度進行了優(yōu)化。制備菌液重懸液 MMA (10mmol/L MgCl2，10 mmol/L Mes，100 μmol/L AS)。分別選擇 MMA OD600為 0.6、0.8、1.0、1.2、 1.4、1.6 的濃度利用種子吸收法對番茄(S. lycopersicum)發(fā)芽種子進行侵染，每種菌液濃度侵染 50 粒發(fā)芽種子在侵染前 MMA 將靜置 3 h。侵染兩周后觀察并記錄不同菌液濃度條件下 GFP 的表達植株數(shù)，并計算番茄中 GFP 的表達效率（統(tǒng)計表達 GFP 的植株數(shù)占總侵染數(shù)的百分比）,重復(fù)試驗兩次。在重懸液 MMA OD600為 1.0 時, GFP 的表達效率更高，3 次實驗的平均值為 86%（圖 2A），因此，利用種子吸收法在番茄(S. lycopersicum)植株中表達外源蛋白的菌液濃度為 OD600=1.0。

 溫度是影響植物生長的關(guān)鍵因素之一，也是影響種子發(fā)芽生長的關(guān)鍵條件，因此我們在菌液濃度條件下，對不同的溫度條件進行種子發(fā)芽培養(yǎng)和農(nóng)桿菌菌液吸收實驗的檢測，重復(fù)試驗兩次，結(jié)果表明在 OD600=1.0 條件下，T = 28℃為種子吸收菌液的溫度，溫度過高時（T﹥30℃）,不利于發(fā)芽種子對菌液的吸收，從而影響了外源基因在植物中的表達。

利用農(nóng)桿菌侵染植物葉片后要進行暗培養(yǎng) 24 h 左右，同樣在菌液侵染后進行了暗培養(yǎng)優(yōu)化實驗，將暗培養(yǎng)時間分別設(shè)為 12 h、24 h、36 h 和 48 h 來檢測種子吸收法的暗培養(yǎng)時間，重復(fù)試驗兩次。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著暗培養(yǎng)時間的適當(dāng)延長，能夠有效提高種子吸收法的表達效率。

利用種子吸收法在番茄中表達 GFP

首先在轉(zhuǎn)錄水平上對基因 GFP 的表達進行了檢測。根據(jù)紫外條件下的觀察結(jié)果，GFP蛋白主要在莖和葉片中積累。分別從侵染后 14 d（dpi）的番茄(S. lycopersicum)葉片和莖中提取總 RNA 為模板，進行 RT-PCR 反應(yīng)，使用 Actin 作為內(nèi)參。半定量 PCR 的結(jié)果表明葉片中比莖中的 GFP 表達水平高（圖 3A）。由于植物葉片為生產(chǎn)外源蛋白的主要器官，以侵染后 14 d 的葉片為植物材料采用 PBS 法提取總可溶性蛋白，對 GFP 蛋白的表達水平進行定量分析，即運用 Bradford 建立的考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質(zhì)結(jié)合的方法，在紫外分光光度計下測定其濃度，作標(biāo)準曲線分析，結(jié)果顯示 GFP 蛋白的表達量約占植株葉片總可溶性蛋白的 4.85%。我們又分別提取莖和葉片中的總可溶性蛋白，對莖和葉片中 GFP 的表達量進行 Western blotting 檢測，結(jié)果表明 GFP 在莖和葉片中大量表達。

新型侵染技術(shù)的建立和優(yōu)化

在研究中，我們以 GFP 作為報告基因，對多批侵染的番茄(S. lycopersicum)發(fā)芽種子進行連續(xù) 28 d 的 GFP 表達表型的紫外觀察，掌握了應(yīng)用種子吸收法在番茄中瞬時表達外源

蛋白的過程及特征。確定該方法的菌液重懸液的濃度 OD600值為 1.0。以菌液重懸液濃度進行侵染，侵染后 7 d 在番茄(S. lycopersicum)新生葉片中開始出現(xiàn)綠色熒光現(xiàn)象，侵染后 14 d 葉片中的綠色熒光現(xiàn)象顯著增強，在侵染后的 28 d 內(nèi)綠色熒光持續(xù)存在并在 28 d后逐漸消退。而葉片注射法通常在侵染后 1 周左右可以達到蛋白的更大表達量。因此，與葉片注射法相比，種子吸收法表達外源蛋白的周期較長，這可能與侵染材料（發(fā)芽種子）需要一定的生長過程有關(guān)。而且，根據(jù)我們長期研究和觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn) GFP 蛋白在植物中的表達周期受具體的實驗條件、菌液活性、植物的培養(yǎng)條件等多種因素的影響。

以上研究表明我們建立并優(yōu)化了一種新型的農(nóng)桿菌侵染植物并瞬時表達外源基因的技術(shù)—種子吸收法，利用該技術(shù)在番茄(S. lycopersicum)中成功的表達了報告基因 GFP，其蛋白表達量約占葉片總可溶性蛋白的 4.85%。與 Yang 等[24]研究的根部吸收法（GFP 蛋白的表達量約占總可溶性蛋白的 6%）相比，種子吸收法的表達水平略低。而利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)表達外源蛋白的水平普遍較低，一般可占總可溶性蛋白的 0.01%~1%，因此與穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)相比，種子吸收法具有較強的優(yōu)勢，適合外源蛋白的高水平表達。葉片注射法是瞬時表達系統(tǒng)較為成熟的一種侵染方法，進行外源蛋白表達的效率一般在 90%左右，而種子吸收法的表達效率為 80%左右。這可能由于番茄種子較小，吸收能力較弱，在侵染過程中較難控制番茄發(fā)芽種子的吸收效率而影響了其表達效率。因此，在研究中對番茄種子吸收法進行了多方面的研究來進一步提高其侵染效率和表達效率，從而更有效地表達外源基因，其中利用真空侵染技術(shù)能夠提高 GFP 的表達效率 10%以上。根據(jù) Fan 等研究，我們同樣利用豆科表達載體在大豆(G. max)和豌豆(P. sativum)等植物中進行了相關(guān)的侵染實驗研究。初步研究結(jié)果表明種子吸收法能夠侵染不適合用葉片注射法進行侵染的植物，如豆科、十字花科等，進一步擴大了侵染的宿主范圍。

 種子吸收法更適合規(guī)模化生產(chǎn)

我們所熟知的一些植物瞬時表達系統(tǒng)的侵染技術(shù)，如葉片注射法，真空侵染法，還有摩擦接種技術(shù)等，都具有各自的局限性，葉片注射法人工操作較為繁瑣，需要逐個葉片進行注射；摩擦接種法操作要求嚴格，體外轉(zhuǎn)錄 RNA 容易降解，而且需要逐個葉片進行涂抹接種；真空侵染法對離體葉片和整株進行侵染，植株數(shù)量受到明顯的限制。不難想象這些技術(shù)方法的不便之處都嚴重阻礙了植物瞬時表達系統(tǒng)在規(guī)模化生產(chǎn)上的應(yīng)用和推廣。因此，建立和優(yōu)化更多更有效的侵染技術(shù)對于植物瞬時表達系統(tǒng)的發(fā)展是至關(guān)重要的。我們使用的表達載體 30B通過農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上的T-DNA將植物病毒基因組帶入植物細胞，轉(zhuǎn)錄成 RNA 病毒后再進行植物病毒的高水平復(fù)制和系統(tǒng)性侵染，避免了對 RNA 病毒直接操作，這就為實驗研究提供了重要的基礎(chǔ)條件。我們的研究結(jié)果表明種子吸收法是一種簡單而有效的農(nóng)桿菌侵染方法，具備操作簡便的優(yōu)勢，更適合規(guī)模化生產(chǎn)外源蛋白，具有重要的應(yīng)用價值。同時，這種方法能夠進一步擴大宿主范圍，為實現(xiàn)更多植物的有效侵染提供了有力的理論依據(jù)。