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如何篩選愈傷組織中GFP表達(dá)陽性的組織？

利用美國(guó)路陽便攜式GFP激發(fā)光源在超凈臺(tái)里面可以進(jìn)行無菌環(huán)境操作，美國(guó)路陽便攜式GFP激發(fā)光源照射愈傷組織，操作者佩戴LUV-30A GFP觀察眼鏡幾款觀察到愈傷組織表達(dá)陽性的組織。具體效果見下圖：

用LUYOR-3415RG篩選GFP表達(dá)陽性的楊樹愈傷

1. 培養(yǎng)基的配制注意哪些事項(xiàng)？
植物組織培養(yǎng)到MS培養(yǎng)基，包含十幾種化合物。因?yàn)橛行┗衔锵嘤鰰?huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，影響培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分，準(zhǔn)備MS培養(yǎng)基需要配制多種高倍母液。且配制母液時(shí)，尤其涉及大量元素的母液時(shí)，一定要等一種成分溶解之后，再緩慢的添加另一種成分，切記“一鍋煮”，即不能將各種化合物一齊添加進(jìn)去。可選用Coolaber的MS培養(yǎng)基基鹽（PM1011）在自行加入蔗糖和瓊脂配制MS培養(yǎng)基，既經(jīng)濟(jì)，又高效。
2.  滅菌后培養(yǎng)基不凝膠或者凝膠偏軟怎么辦？
植物凝膠、瓊脂都對(duì)酸性條件敏感，pH值低于5很難成膠或凝膠偏軟，切記高壓滅菌前調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值（5.5-6.0）。植物凝膠對(duì)二價(jià)陽離子濃度有要求，也就是相對(duì)于MS培養(yǎng)基，1/2MS培養(yǎng)基中植物凝膠要適當(dāng)增加用量。另外滅菌后，倒出培養(yǎng)基前一定將培養(yǎng)基搖勻（帶防燙手套），因?yàn)槭黔傊芏却蟮讓雍扛撸菀自斐膳囵B(yǎng)基強(qiáng)度不均勻。選擇Coolaber改良MS培養(yǎng)基（PM10121，pH5.8±0.2）含蔗糖和瓊脂/植物凝膠，可以省去調(diào)pH步驟。
3. 水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分，在使用過程中有無區(qū)別？
水解酪蛋白對(duì)胚狀體、不定芽的分化有良好的促進(jìn)作用，通常用量在500mg/L，不管是酸解還是酶解，作用都是一樣的，酶解更有利于發(fā)揮其作用。
4. 怎么溶解組培常用植物激素？
IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等應(yīng)先溶解于少量95%的乙醇中，再加水定容配制成母液；如有結(jié)晶析出，可考慮用1/10體積的乙醇溶解后再定容；2，4-D易溶于堿性水溶液，可用少量1mol/L的NaOH溶液溶解后再慢慢加水定容；KT和6-BA先用少量的HCL溶解，再加水定容到一定的濃度。
5. 細(xì)胞分裂素使用濃度？
一般情況下在培養(yǎng)基中加入0.1~10.0mg/L的細(xì)胞分裂素（6-BA/KT/ZT)，多數(shù)用1.0~2.0mg/L，KT濃度為0.5~2mg/L，這個(gè)也要根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料來調(diào)整。細(xì)胞分裂素可以單獨(dú)使用也可以與細(xì)胞生長(zhǎng)素配合使用。
6. 哪些植物激素能高壓滅菌，哪些不能高壓滅菌？
IBA、NAA、6-BA、2,4-D可高溫高壓滅菌。 IAA、GA3、茉莉酸等不可高溫高壓滅菌，否則會(huì)分解失效，該類植物激素配制母液后需用0.22微孔濾膜過濾除菌，待培養(yǎng)基冷卻（50-60℃）后尚未凝膠前加入混勻。
7. 培養(yǎng)基的pH值會(huì)凝膠硬度有無影響？
有影響。若將培養(yǎng)基pH值調(diào)的過高（大于6），則培養(yǎng)基偏硬，增加接種的阻力，會(huì)對(duì)外植體造成損傷。若將培養(yǎng)基pH值調(diào)的過低（小于4.5），則培養(yǎng)基不能凝固，起不到固定外植體的作用。一般將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至5.5~6.0為宜。
8. 滅菌過程會(huì)否影響培養(yǎng)基的pH值？
培養(yǎng)基中的蔗糖和激素在高溫滅菌過程中容易酸化，培養(yǎng)基pH值滅菌后會(huì)有所下降，滅菌前培養(yǎng)基的pH值偏低可能導(dǎo)致培養(yǎng)基不凝或偏軟。要求偏酸性的培養(yǎng)基可適當(dāng)增加瓊脂或植物凝膠的用量。
9. 應(yīng)用75%的酒精進(jìn)行種子xiaodu的過程中需要注意的問題？
種子在xiaodu過程中使用75%的酒精使用應(yīng)慎重，酒精滲透力，xiaodu時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)直接影響種子發(fā)芽率，所以建議LED紫外線燈xiaodu時(shí)間不應(yīng)超過1min。

10. 原始繁殖材料如何xiaodu？
組培中，作為原始繁殖材料的外植體xiaodu，直接影響整個(gè)培養(yǎng)過程的進(jìn)行。從室外采回來的外植體需進(jìn)行xiaodu，首先用自來水沖洗外植體，沖洗時(shí)間可根據(jù)采集部位不同而定，一般在5~15分鐘即可；關(guān)鍵在于在超凈臺(tái)中進(jìn)行藥劑的處理，常用的藥劑處理有70%的乙醇溶液、9%的次氯酸鈉溶液、和0.1~0.2%的溶液，具體可根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料而定。應(yīng)注意的是經(jīng)滅菌的外植體必須用無菌水沖洗6~8次。
11. 怎么處理植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的各種污染？
植物組織培養(yǎng)過程中的污染來源主要分為3種，真菌、細(xì)菌和組織培養(yǎng)過程中的污染源。在操作過程中，難免有菌落入培養(yǎng)基或植物材料上，而導(dǎo)致污染。另外，不正確操作也會(huì)增加污染機(jī)率。
預(yù)防措施：通風(fēng)，保持室內(nèi)空氣干燥，紫外殺菌等。污染物品和污染培養(yǎng)基不要在培養(yǎng)室近距離開瓶洗刷。
污染原因判斷：
（1）培養(yǎng)基污染   若污染菌類是零星分散在培養(yǎng)基中，則可確定是人為引起的污染。比如培養(yǎng)基滅菌不，開瓶時(shí)間過長(zhǎng)，滅菌后存放時(shí)間過長(zhǎng)等； 高溫蒸汽滅菌器的溫度、壓力、時(shí)間沒有正確設(shè)置；過濾滅菌過程中濾膜孔徑選擇、過濾滅菌器的滅菌處理、過濾滅菌操作等均會(huì)影響培養(yǎng)基的滅菌效果。
措施：嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)要求，滅菌規(guī)程操作。
（2）外植體污染   若污染菌類是從材料周圍長(zhǎng)起，且發(fā)生在5天以后，則說明是材料帶的內(nèi)生菌。可能是接種用具滅菌不，接種時(shí)材料被污染；若從培養(yǎng)基以下開始長(zhǎng)菌，發(fā)生時(shí)間較早，且有從里向外的趨勢(shì)，則說明是切口引起的污染，原因可能是未剪去兩個(gè)切口或者雖剪去切口但是所用器具帶菌；或者是未及時(shí)發(fā)現(xiàn)污染苗，接種過程中引起交叉污染；
措施：取材時(shí)應(yīng)仔細(xì)選擇，以減少污染的發(fā)生。
（3）操作環(huán)節(jié)污染  接種室是否清潔、干燥、密封，是否經(jīng)常用短波紫外線燈照射、甲醛熏蒸、70%的酒精噴霧殺菌等；超凈工作臺(tái)擺放物品雜亂，長(zhǎng)時(shí)間不換濾網(wǎng)，導(dǎo)致凈化能力降低；接種用具滅菌不引起污染；操作不正確等。
措施：每次接種前半個(gè)小時(shí)，用20%的新潔爾擦洗室內(nèi)設(shè)備、工作臺(tái)面，再用短波紫外線燈照射20min。還可以噴灑70%的乙醇進(jìn)行xiaodu。除了培養(yǎng)基、接種材料、器具和用具保證無菌外，同時(shí)在接種時(shí)還需要嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作。
出現(xiàn)污染后處理措施：
（1）真菌污染后，如果已形成孢子，則必須經(jīng)高壓滅菌后扔掉；若使細(xì)菌污染，只要及時(shí)發(fā)現(xiàn)，將材料上部未感染菌的部分剪下轉(zhuǎn)接，材料仍可以用。
（2）用抗生素等殺菌藥劑的處理。但至今還未發(fā)現(xiàn)哪種抗生素能夠?qū)Ω鞣N菌都有效，并且常常也會(huì)影響植物材料的正常生長(zhǎng)分化。另一些藥劑，雖有的殺菌效果好，但往往容易引起鹽害，也無法利用。
12. 外植體的如何選擇？
為了使接種后的誘導(dǎo)得以成功，選擇的外植體應(yīng)該是幼嫩的，處于生長(zhǎng)旺盛時(shí)期的，而且選擇的外植體的體積不能過小，如若過小則會(huì)影響愈傷組織的形成，從而影響進(jìn)一步的分化。因此，一般接種的外植體體積在0.5~1.0cm2的范圍內(nèi)即可。的為莖尖、帶芽莖段，也可以利用葉子、子葉、根段、花器官組織等。
13. 植物莖段組織培養(yǎng)需要注意哪些問題？
以莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)比較容易，一般取植物的嫩莖切段作為外植體，切成0.5~1cm長(zhǎng)的小段進(jìn)行接種，保證每個(gè)莖段有一個(gè)芽點(diǎn)和一片葉子，將芽點(diǎn)部位以下垂直插入培養(yǎng)基凝膠中進(jìn)行生根培養(yǎng)。
14. 外植體接種需要注意的操作事項(xiàng)？
接種前首行滅菌xiaodu，接種所用的鑷子、、剪刀等工具需要提前高溫高壓滅菌，提分鐘打開超凈工作臺(tái)，短波高強(qiáng)度紫外線燈照射15~20min，操作人員要用75%的酒精棉球擦手、工作臺(tái)和器皿，和鑷子等隨時(shí)擦酒精灼燒，晾涼后備用。在無菌培養(yǎng)皿中或?yàn)V紙上切割外植體，接種到培養(yǎng)基表面，注意瓶口傾斜接近酒精燈火焰。
15. 組織培養(yǎng)中材料褐化現(xiàn)象如何解決？
不同品種以及生理狀態(tài)引起的褐化狀態(tài)不同。培養(yǎng)基過高濃度的無機(jī)鹽及高水平細(xì)胞分裂素會(huì)使褐化現(xiàn)象加重。培養(yǎng)條件不當(dāng)，例如光照過強(qiáng)、溫度過高、培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加重外植體的褐變程度。
防治措施：選擇合適的外植體。選擇生長(zhǎng)處于旺盛的外植體，可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。合適的培養(yǎng)條件，無機(jī)鹽成分、植物生長(zhǎng)物質(zhì)水平、適宜溫度、及時(shí)繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。使用抗氧化劑，在培養(yǎng)基中，使用半、抗壞血酸、PVP等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外使用0.1%~0.5%的活性炭對(duì)防止褐變也有較為明顯的效果。連續(xù)轉(zhuǎn)移，對(duì)容易褐變的材料可間隔12~24小時(shí)的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7~10天后，褐變現(xiàn)象便會(huì)得到控制或大為減輕。

16. 材料玻璃化如何解決？
植物材料不斷地進(jìn)行離體繁殖時(shí)，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會(huì)呈半透明狀，呈水跡狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥，試管苗生長(zhǎng)緩慢、玻璃化的嫩莖不宜誘導(dǎo)生根，繁殖系數(shù)有所下降。當(dāng)培養(yǎng)基上細(xì)胞分裂素水平較高時(shí)，容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。愈傷組織的玻璃化問題主要表現(xiàn)在培養(yǎng)過程中愈傷組織松散，脆易碎。葉子或是長(zhǎng)出的愈傷一段時(shí)間后在其周圍出現(xiàn)水漬化，繼而影響整個(gè)培養(yǎng)基。
防治措施: 在培養(yǎng)基中添加少量、脫落酸等物質(zhì)，降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素含量及含氮化合物的用量，選用低NH4+水平的B5培養(yǎng)基，都能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。增加光照，對(duì)減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；在培養(yǎng)基中添加活性炭、馬鈴薯汁、等可有效的減輕和防止玻璃化。
17. 材料水浸狀、變色、壞死、莖斷面附近干枯如何解決？
可能原因：表面殺菌劑過量，xiaodu時(shí)間過長(zhǎng)，外植體選用不當(dāng)（部位或時(shí)期）。
改進(jìn)措施：調(diào)換其他殺菌劑或降低濃度，縮短xiaodu時(shí)間，試用其他部位，生長(zhǎng)初期取材。
18. 材料長(zhǎng)期培養(yǎng)幾乎無反應(yīng)怎么辦？
可能原因：培養(yǎng)基不適合，生長(zhǎng)素的選擇和用量不當(dāng)，植物激素對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育和生理過程的調(diào)節(jié)作用，往往不是某一種植物激素的單獨(dú)效果。環(huán)境溫度不適宜。
改進(jìn)措施：更換培養(yǎng)基或調(diào)整培養(yǎng)基成分，尤其是調(diào)整鹽離子濃度；調(diào)整激素的種類與配比，增加生長(zhǎng)素用量，例如使用人工合成的生長(zhǎng)素類似物2，4-D等可有效促進(jìn)細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)，新器官的分化和形成；調(diào)整培養(yǎng)溫度等環(huán)境條件。
19. 愈傷組織生長(zhǎng)過旺疏松怎么辦？
可能原因： 由于培養(yǎng)基中激素添加過量，培養(yǎng)室溫度偏高，礦物質(zhì)等無機(jī)鹽含量不當(dāng)?shù)纫蛩匾鸬摹?br>改進(jìn)措施：根據(jù)不同的品種、不同組織、不同器官，應(yīng)適當(dāng)減少激素用量，適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整無機(jī)鹽（尤其是銨鹽）含量，適當(dāng)提高瓊脂用量增加培養(yǎng)基硬度，避免愈傷組織生長(zhǎng)過旺和疏松現(xiàn)象發(fā)生。
20. 愈傷組織生長(zhǎng)緩慢太緊密怎么解決？
可能原因：細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的用量過多，糖濃度過高。
改進(jìn)措施：減少細(xì)胞分裂素用量，調(diào)整細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比例，降低糖濃度。
21. 愈傷組織分化率低，畸形，分化出的芽多為葉狀芽或叢芽，芽生長(zhǎng)困難，不易成苗。培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)時(shí)，再次愈傷組織化
可能原因：生長(zhǎng)素用量偏高，溫度偏高。
改進(jìn)措施：減少生長(zhǎng)素用量，可以通過分化培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)基中添加GA3（濃度在0.5~2mg/L之間）解決，并適當(dāng)降低愈傷組織的培養(yǎng)溫度。
22. 叢生苗過于細(xì)弱，不適于生根或移栽
可能原因：細(xì)胞分裂素濃度過高或赤霉素使用不當(dāng)，產(chǎn)生過多的不定芽；溫度過高，光照短，光強(qiáng)不足；不及時(shí)的轉(zhuǎn)移和分切，生長(zhǎng)空間小。
改進(jìn)措施：減少細(xì)胞分裂素用量，免用赤霉素；延長(zhǎng)光照時(shí)間，增強(qiáng)光照；及時(shí)轉(zhuǎn)接；降低接種密度；更換透氣的封口膜等。
23. 組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)黃化如何解決？
引起黃化的主要原因是培養(yǎng)基中Fe的含量不足，各種礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不均衡；培養(yǎng)環(huán)境通氣不良，瓶?jī)?nèi)有害氣體積累（乙烯、氨氣、甲醛）等會(huì)引起植物材料黃化脫落；激素配比不當(dāng)；糖用量不足或長(zhǎng)時(shí)間不轉(zhuǎn)移；pH值變化過大；培養(yǎng)溫度不適；光照不足等。
改進(jìn)措施：改善組培條件，在配制培養(yǎng)基過程中檢查儀器設(shè)備是否準(zhǔn)確；降低組培苗的接種密度，及時(shí)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物；使用透氣的封口膜改善瓶?jī)?nèi)通氣狀況；適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值、激素配比和無機(jī)鹽濃度；控制培養(yǎng)室內(nèi)溫度，適當(dāng)增加光照。
24. 植物組培培養(yǎng)基都有哪些？
MS培養(yǎng)基：1962年穆拉和斯庫格為煙草細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)，其中硝酸鹽的濃度高，適合植物原生質(zhì)體、細(xì)胞和組織培養(yǎng)。
B5培養(yǎng)基：1968年甘伯爾格為大豆細(xì)胞培養(yǎng)而設(shè)計(jì)，銨的濃度低。適合木本植物的組織和細(xì)胞培養(yǎng)。
富鹽平衡培養(yǎng)基：是目前使用泛的一類，特點(diǎn)是：無機(jī)鹽濃度高，微量元素種類齊全，濃度高；元素間比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖能力、穩(wěn)定性好、營(yíng)養(yǎng)豐富，一般培養(yǎng)時(shí)無需再加入有機(jī)成分。
高硝態(tài)氮培養(yǎng)基：代表性培養(yǎng)基有B5、N6、SH。特點(diǎn)是：硝酸鉀濃度高，氨態(tài)氮濃度低，含有較高濃度的硫胺素（VB1）。
中鹽培養(yǎng)基：大多是在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行改良設(shè)計(jì)。特點(diǎn)是：大量元素?zé)o機(jī)鹽為MS的一半，微量元素種類減少、含量增高。維生素種類比MS增多，例如增加了、等。
低鹽培養(yǎng)基：特點(diǎn)是：無機(jī)鹽、有機(jī)成分含量濃度低，多用作生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基。
25. 木本植物（油料植物）組織培養(yǎng)中遇到再生苗無法生根時(shí)怎么辦？
一般常用的1/2MS或者1/2WPM基本能夠滿足。如果增殖用的基本都生產(chǎn)正常，到生根的時(shí)候出現(xiàn)落葉，只能通過排除法一樣樣分析。首先看下是不是培養(yǎng)溫度太高，使用瓶蓋后透氣性差，導(dǎo)致乙烯積累。其次，可以適當(dāng)添加少量分裂素，或者更換生長(zhǎng)素，以及多種生長(zhǎng)素混合使用。
26. 培養(yǎng)基中添加糖類作為碳源物質(zhì)，有何重要作用？
同樣作為碳源為植物細(xì)胞提供能量來源，蔗糖較葡萄糖能更好地調(diào)節(jié)培養(yǎng)基內(nèi)的滲透壓。微生物生長(zhǎng)所需的碳源的是葡萄糖，采用蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源，可一定程度上減少微生物的污染。生長(zhǎng)素和蔗糖濃度決定愈傷組織中維管束的類型與數(shù)量。
27. 用于植物原生質(zhì)體制備的材料，以及常用的滲透壓調(diào)節(jié)劑
用于植物原生質(zhì)體的材料需要選取生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞，幼嫩的組織。無菌試管苗的葉片、胚軸及子葉、花藥，以及愈傷組織（懸浮細(xì)胞）等。常用的調(diào)節(jié)原生質(zhì)體滲透壓的穩(wěn)定劑主要有、、葡萄糖、蔗糖等。滲透壓濃度一般為0.3~0.8 mol/L。
28. 組培苗移栽需要注意哪些問題？
在移栽前打開三角瓶的封口膜，煉苗3~5d后取出小苗，用流水洗凈根部的培養(yǎng)基，然后移栽到盛有滅過菌的蛭石的營(yíng)養(yǎng)缽中過度一下，但要注意不可直接向營(yíng)養(yǎng)缽中澆營(yíng)養(yǎng)液（容易長(zhǎng)菌），用透明的塑料薄膜罩住小苗3~5d后移栽到土里。
29. 光照強(qiáng)度多少lux是如何計(jì)算？
光照強(qiáng)度=光通量/單位面積。Lux的換算比較抽象，一般以燭光為計(jì)算單位，現(xiàn)在所用的以電源發(fā)光的光源，記作國(guó)際燭光，即25瓦特的電燈其光強(qiáng)度等于25國(guó)際燭光。1標(biāo)準(zhǔn)燭光=10.76 Lux。
30. 植物組織培養(yǎng)中的LED光源如何選擇？
光是植物生長(zhǎng)中最重要的環(huán)境因子之一，并不是所有的光都有助于植物的光合作用。LED光源波長(zhǎng)460nm左右的藍(lán)光和波長(zhǎng)660nm左右的紅光是植物最需要的光波，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著關(guān)鍵性的作用。